背景簡介
狹義的轉錄組默認隻包含mRNA，但是廣義的轉錄組指的是細胞或組織中所有轉錄産物的集合，其中包含mRNA和非編碼RNA（non-coding RNA, ncRNA）。非編碼RNA目前的研究多集中在具有調控功能(néng)的small RNA（以miRNA爲代表），長(cháng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）和環狀RNA（circular RNA, circRNA）上，而這(zhè)幾類ncRNA的調控對(duì)象都(dōu)和mRNA有關。因此，全轉錄組即包含了ncRNAs和mRNA。全轉錄組測序即對(duì)以上四種(zhǒng)ncRNA進(jìn)行測序，并分析這(zhè)四者之間複雜的相互作用關系。
技術優勢
文庫優化：針對(duì)不同長(cháng)度序列采用兩(liǎng)種(zhǒng)文庫構建方法，去核糖體鏈特異性文庫可獲得mRNA、lncRNA和circRNA信息。
數據全面(miàn)：全轉錄組測序可獲取4類主要RNA（miRNA，mRNA，lncRNA，circRNA）數據，可對(duì)這(zhè)些數據進(jìn)行标準分析及整合分析
關聯全面(miàn)：通過(guò)對(duì)mRNA /miRNA/lncRNA/circRN序列測定及後(hòu)續分析，深入開(kāi)展全轉錄組調控網絡(ceRNA網絡)分析
技術路線
分析内容
樣本類型
細胞，組織，體液、血清、血漿、全血，總RNA等
建議總RNA起(qǐ)始量：＞15 μg，濃度≥200 ng/μL
近期用戶文章
1. Sun JC, et al. (2016) A computationally constructed ceRNA interaction network based on a comparison of the SHEE and SHEEC cell lines. Cell Mol Biol Lett 21 (1) :21.
2. Wang Wei, et al. (2017) Identification of miRNA, lncRNA and mRNA-associated ceRNA networks and potential biomarker for MELAS with mitochondrial DNA A3243G mutation. Scientific Reports 7 :41639.
Q1：全轉錄組測序爲什麼(me)需要構建兩(liǎng)個文庫？
A：全轉錄組測序需要構建2個測序文庫，一個小RNA文庫和一個去除核糖體RNA的鏈特異性文庫，然後(hòu)分别上機測序。小RNA長(cháng)度較短，一般小于50nt，采用測序策略爲50SE。其他三類RNA序列一般大于200，通常在1000以上，最高可達幾萬，通過(guò)片段化構建150PE測序文庫。最後(hòu)小RNA文庫可以獲得miRNA序列信息，去核糖體的鏈特異性文庫可以獲得mRNA、lncRNA和circRNA的序列信息。
Q2：什麼(me)是ceRNA調控網絡（ceRNA networks）？
A：一些非編碼RNA，如lncRNA和circRNA等會(huì)競争結合miRNA，導緻miRNA調控的靶基因發(fā)生變化。這(zhè)類新型的非編碼RNA除了轉錄前調控等功能(néng)外，一個重要的功能(néng)就(jiù)是像海綿一樣對(duì)miRNA有吸附作用。這(zhè)種(zhǒng)具有miRNA吸附作用的RNA，我們稱作内源性競争結合RNA（Competitive endogenous RNA, ceRNA），具體的相互作用關系如下圖：
circular RNA(HRCR)靶标結合miR-223保護心髒免受心肌肥厚和心髒衰竭
本研究中作者首先通過(guò)miRNA基因芯片分析、Northern blot、RT-PCR等技術手段發(fā)現，ISO處理14天後(hòu)，miRNA-223的表達量顯著上調，并且在患有心髒肥厚和心髒衰竭的人和小鼠心髒中miRNA-223的表達量也有明顯的上調，初步得出結論：miRNA-223參與調控心肌肥厚和心髒衰竭。接下來作者利用miR-223過(guò)表達轉基因小鼠以及miR-223基因敲除轉基因小鼠進(jìn)一步驗證表型，結果發(fā)現miR-223過(guò)表達小鼠成(chéng)年後(hòu)出現明顯的心肌肥厚和心髒衰竭症狀，而miR-223基因敲除小鼠表型相反，進(jìn)一步證明在活體内，miR-223可以誘導心肌肥厚和心髒衰竭。
接下來作者進(jìn)一步研究miR-223對(duì)心肌細胞的影響，結果發(fā)現miR-223過(guò)表達細胞中出現明顯的心肌肥大反應，而miR-223敲除細胞中，ISO處理引起(qǐ)的心肌肥大反應明顯被破壞，說(shuō)明miR-223過(guò)表達會(huì)促進(jìn)心肌肥厚，而miR-223基因敲除會(huì)阻斷心肌肥厚。
爲了進(jìn)一步研究miR-223調控心肌肥厚和心髒衰竭的分子機制，作者篩選了一些參與調控心肌肥厚的基因作爲miR-223的靶标候選基因，然後(hòu)通過(guò)western blot分析miR-223過(guò)表達和缺失突變體中上調以及下調的基因，結果發(fā)現miR-223可以顯著抑制ARC的表達，而前人已經(jīng)有研究報道(dào)ARC參與調控心肌肥厚和細胞凋亡，所以初步推斷ARC可能(néng)是miR-223下遊的靶标位點。
接下來作者通過(guò)RNAhybrid分析發(fā)現，ARC的3′UTR含有潛在的miR-223的結合位點，然後(hòu)通過(guò)Target Protector technology進(jìn)一步證明miR-223可以特異調控ARC的表達，ARC 3′UTR的翻譯活性受到miR-223的抑制。
接下來作者構建了一個不帶ARC 3′UTR的腺病毒載體，這(zhè)種(zhǒng)病毒載體對(duì)miR-223不敏感，結果發(fā)現這(zhè)種(zhǒng)腺病毒可以減弱ISO處理誘導的心肌肥厚反應。然後(hòu)作者通過(guò)ARC過(guò)表達轉基因株系進(jìn)一步證明了ARC可以保護心髒免受心肌肥厚和心髒衰竭，減少細胞凋亡。以上這(zhè)些研究結論表明：在調控心肌肥厚和心髒衰竭的過(guò)程中，ARC是miR-223的下遊靶标位點。
CircRNA和miRNA的互作是目前研究的一個熱點話題，爲了進(jìn)一步研究是否有CircRNA參與調控miR-223的表達，作者從CircRNA數據庫中随機篩選出100個CircRNA，通過(guò)qRT-PCR驗證篩選到36個CircRNA，然後(hòu)通過(guò)Northern blot篩選到一個特異性表達的CircRNA: mm9-circ-012559(HRCR)。
然後(hòu)作者通過(guò)RNAhybrid分析發(fā)現HRCR包含6個CircRNA的靶标結合位點，初步表明HRCR可以和miR-223結合。接下來作者通過(guò)生物素标記，qRT-PCR，Northern bolt，pull down assay、熒光原位雜交（FISH）等技術手段，從正向(xiàng)以及反向(xiàng)兩(liǎng)個角度分别驗證HRCR和miR-223之間的互作關系，結果發(fā)現miR-223和HRCR在細胞質中存在共定位現象，HRCR可以直接結合到miR-223上。
HRCR和miR-223存在互作，而miR-223可以通過(guò)調控下遊ARC的表達，進(jìn)而調控心肌肥厚和心髒衰竭，爲了進(jìn)一步研究HRCR對(duì)ARC表達的影響，作者構建了HRCR過(guò)表達載體和基因敲除突變體，結果發(fā)現HRCR過(guò)表達載體中，ARC的表達量和活性顯著增加，HRCR敲除突變體中，ARC的表達量和活性顯著降低，并且HRCR可以消除miR-223對(duì)ARC表達的抑制作用，說(shuō)明HRCR可以通過(guò)調控miR-223以及ARC的表達，進(jìn)而調控心肌肥厚。
參考文獻
Wang K, Long B, Liu F, et al. A circular RNA protects the heart from pathological hypertrophy and heart failure by targeting miR-223.[J]. European Heart Journal, 2016, 37(33):2602-2611.
