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磷酸化蛋白質組學(xué)

目    錄
  • 産品介紹
  • 常見問題
  • 經(jīng)典案例
  • 結果展示

背景簡介 
蛋白質發(fā)生翻譯後(hòu)修飾時(shí)其分子質量會(huì)發(fā)生相應的改變,通過(guò)質譜能(néng)夠精确測定蛋白質或多肽的分子質量。蛋白質磷酸化是一種(zhǒng)非常重要且廣泛存在于原核生物和真核生物中的翻譯後(hòu)修飾調控方式, 參與細胞的增殖、發(fā)育、分化、凋亡,細胞骨架調控、神經(jīng)活動、肌肉收縮、新陳代謝及腫瘤發(fā)生等。由于磷酸化修飾的蛋白質在生物樣本中含量低、動态範圍廣,利用定量蛋白組學(xué)分析手段對(duì)富集得到的磷酸化肽段樣品進(jìn)行定量分析前,需要對(duì)修飾進(jìn)行富集從而提高修飾蛋白豐度。通過(guò)蛋白定量技術和修飾富集技術相結合,可對(duì)樣本中翻譯後(hòu)修飾進(jìn)行相對(duì)定量,篩選差異修飾位點和差異修飾蛋白。
   
技術優勢 
全面(miàn)性:以整個細胞所有蛋白爲研究對(duì)象,囊括了細胞内所有具有生命功能(néng)的蛋白
可靠性:可一次性全面(miàn)檢測不同蛋白激酶及磷酸化酶對(duì)同一個蛋白磷酸化程度的影響,
因而結果更加普遍性和可靠性
高效性:磷酸化蛋白質組學(xué)反映的是細胞内真實發(fā)生的事(shì)件,考慮了各種(zhǒng)變量,
克服了經(jīng)典生物學(xué)中逐步添加變量的缺陷,更爲高效
探索性:磷酸化蛋白質組學(xué)以細胞内全部蛋白質爲研究對(duì)象,相對(duì)于傳統的生物學(xué)研究
以及蛋白質芯片,更易發(fā)現未知的新磷酸化位點和磷酸化蛋白質
 
技術路線 


 
分析内容 
 
 
樣本類型 
蛋白樣品:1mg以上
組織樣品:植物組織樣本200mg以上,
血液樣品1ml以上(血漿注意用EDTA防凝),
尿液2ml,動物組織樣品至少1g,
細胞樣品爲5X107個細胞,
酵母、微生物等幹重200mg

 

磷酸化蛋白質組揭示晝夜節律調控機制
Phosphorylation Is a Central Mechanism for Circadian Control of Metabolism and Physiology
研究對(duì)象:小鼠肝髒
期 刊:Cell Metabolism
影響因子:18.164
發(fā)表單位:馬克斯普朗克研究所 
發(fā)表時(shí)間:2017年1月
研究背景
生物鍾,作爲生物體内一種(zhǒng)無形的時(shí)鍾,控制著(zhe)生物體内幾乎全部的代謝過(guò)程,并且其自身會(huì)不斷優化以保證生物體的穩态和代謝健康。生物鍾節律的紊亂會(huì)導緻一系列的疾病,如糖尿 病、肥胖和代謝疾病。研究生物鍾,在醫學(xué)上有著(zhe)重要的意義,并對(duì)生物學(xué)的基礎理論研究起(qǐ)著(zhe)促進(jìn)作用。許多研究已經(jīng)利用轉錄組和蛋白質組技術研究了晝夜節律,但是磷酸化蛋白質 組尚未涉及。
研究策略
取樣策略:小鼠肝髒組織,兩(liǎng)天之中每3小時(shí)取樣一 次,每組4個生物學(xué)重複
質譜策略:磷酸化蛋白質組 TiO2富集,Label-free定量技術,Q Exactive HF質譜檢測,MaxQuant 搜庫
後(hòu)續驗證:轉錄激活分析 ,Western Blotting 驗證
研究結果
1. 體内大規模晝夜磷酸化蛋白質組
小鼠肝髒組織中共鑒定到20,404個磷 酸化肽段,20,076個磷酸化位點, 4,461個磷酸化蛋白,且定量重複性 較高。
 
2. 小鼠肝髒磷酸表達水平每天大幅度振蕩
其中27%的磷酸化肽段,41%的磷酸化蛋白表達水平 在2天内發(fā)生大幅度變化(圖1A)。表達水平聚類分 析,可以將(jiāng)磷酸化肽段分爲光照和黑暗兩(liǎng)大類(圖 1B)。PCA分析表明,磷酸化蛋白質組循環周期爲一 天(圖1C)。肝髒磷酸化蛋白質富集到不同代謝通 路,表明翻譯後(hòu)修飾在晝夜節律調控中起(qǐ)著(zhe)關鍵作用 (圖1 D)。
蛋白質表達量和磷酸化蛋白表達量均随晝夜節律振 蕩,但是磷酸化蛋白質表達量振蕩幅度更大(圖 2A,圖2B)。蛋白質表達水平平均差異倍數爲1.2, 磷酸化蛋白質表達水平平均差異倍數爲5倍(圖 2C)。FC值累計曲線表明,80%的磷酸化累積強度 來自于20%的磷酸化水平振蕩的肽段,表明磷酸化水 平變化的蛋白爲調控蛋白而非結構蛋白(圖2D)。
 
3. CLOCK蛋白上氨基酸位點的磷酸化循環
小鼠肝髒中CRY1 S588和CRY2 S557分别在 CT0和CT21表達量達到峰值(圖3A)。在 CLOCK蛋白上發(fā)現了新的磷酸化位點S446和 S440/441,其磷酸化水平也出現周期性的變 化(圖3B),這(zhè)些氨基酸殘基位于蛋白質序 列中富含絲氨酸的區域,在哺乳動物中高度保 守(圖3C)。CLOCK磷酸化突變體轉錄活性 低于野生型,然而CRY1介導的轉錄抑制不受 影響(圖3D,圖3E)。結果表明,CLOCK蛋 白上的S440 / S441和S446的體内磷酸化循環 在不含CRY1介導的抑制的情況下即可調節其 轉錄活性。
 
4. 晝夜節律中小鼠肝髒激酶活性調控
激酶富集分析結果表明,ERK底物和AK- T/mTOR底物磷酸化水平在白天和晚上分 别達到峰值(圖4A)。與 EGFR-RAS-ERK-RSK級聯反應相關的激酶 磷酸化水平在白天達到峰值,這(zhè)些酶多爲 糖酵解,糖原合成(chéng)和脂肪合成(chéng)的限速酶, 使得小鼠在食物攝入最少的時(shí)候促進(jìn)糖酵 解提供能(néng)量,抑制糖原和脂肪的合成(chéng)。與 insulin-AKT-mTOR 級聯反應相關酶的磷 酸化水平在夜晚達到峰值,此時(shí)小鼠活動 活躍,營養充足,使得脂肪合成(chéng)、生長(cháng)相 關的代謝途徑比較旺盛(圖4 B)。


 

功能(néng)注釋結果圖  圖中每個圈代表一個數據庫的注釋結果, 重疊部分代表多個數據庫共同注釋到的 蛋白, 非重疊部分代表相應數據庫單獨 注釋到的蛋白。


motif 分析圖每個樣品隻顯示一個 motif 圖,極性 氨基酸(G, S, T, Y, C)顯示爲綠色,中性氨基酸(Q,N) 顯示爲紫色,堿 性氨基酸(K, R, H) 顯示爲藍色,酸 性氨基酸(D,E)顯示爲紅色,疏 水氨基酸 (A, V, L, I, P, W, F, M)顯示爲黑色。  


差異蛋白聚類熱圖縱向(xiàng)是樣品的聚類,橫向(xiàng)是蛋白聚類, 聚類枝越短代表相似性越高。 從縱向(xiàng) 聚類可以看出樣品間蛋白含量的表達模式聚類。


富集有向(xiàng)無環圖(Cellular component)圖中的比較對(duì)順序和 GO 條目柱狀圖 中順序一緻。每個方框或圓圈代表一 個 GO term, 放大方框中内容從上 到下代表的含義依次爲:GO term 的ID、GO 的描述、GO 富集的 Adjuste dPv、 該GO下差異蛋白的數目/該GO 下背景蛋白的數目。


 

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