Q1：Infinium甲基化檢測需要多少DNA？

A：進(jìn)入亞硫酸氫鹽轉化，手動方案至少需要500 ng，自動化方案至少需要1000 ng。

Q2：Infinium Methylation Assay是單色還(hái)是雙色測定？

A：這(zhè)是一種(zhǒng)雙色測定。對(duì)于基于Infinium I Assay設計的Infinium HumanMethyation27 BeadChip測定，摻入的顔色取決于被查詢的CpG基因座之前的堿基。這(zhè)可以是綠色或紅色。Infinium HumanMethylation450 BeadChip測定包括Infinium I和Infinium II研究設計。在後(hòu)一種(zhǒng)情況下，從探針序列的3'末端（其是查詢堿基上遊的一個堿基）的單個堿基延伸將(jiāng)導緻紅色或綠色信号，這(zhè)取決于查詢位點是否未甲基化或甲基化。
 

案例一：I期非小細胞肺癌的DNA甲基化标志物

爲了探索I期非小細胞肺癌（NSCLC）可利用的生物标志物，本案例采用 Illumina 450K甲基化芯片對(duì)444例非小細胞肺癌樣本進(jìn)行研究，發(fā)現了10000個甲基化差異位點。基于這(zhè)些位點進(jìn)行非監督層次聚類分析，可以將(jiāng)患者明顯區分爲預後(hòu)好(hǎo)壞兩(liǎng)類。

 
圖1. 非小細胞肺癌樣本的非監督層次聚類分析

案例二：甲基化芯片與轉錄組聯合分析

本案例利用Illumina 450K甲基化芯片研究了多發(fā)性硬化影響的腦組織與正常腦組織的DNA甲基化差異，結果發(fā)現甲基化差異細微，但是差異是普遍存在的并且具有可重複性。通過(guò)RNA-seq研究發(fā)現，多發(fā)性硬化影響的腦組織相比正常腦組織，調節少突膠質細胞存活的基因，如BCL2L2和NDRG1是高甲基化的并且基因表達水平較低；而與蛋白水解加工相關的基因，如LGMN和CTSZ則是低甲基化并且基因表達水平較高。這(zhè)些結果表明基因甲基化程度的改變會(huì)影響腦組織對(duì)于損傷的敏感性。

 圖2. mRNA表達水平與啓動子甲基化相關性分析

參考文獻

[1] Sandoval J, Mendez-Gonzalez J, Nadal E, et al. A Prognostic DNA Methylation Signature for Stage I Non–Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology, 2013; 31(32): 4140-4147.
[2] Huynh J, Garg P, Thin T, et al. Epigenome-wide differences in pathology-free regions of multiple sclerosis- affected brains. Nature neuroscience, 2014; 17(1): 121-130.

案例三：早期肝癌術後(hòu)複發(fā)可預測甲基化位點标記

在全世界分範圍内，每年因肝癌死亡的病例超過(guò)50萬人，是主要的因癌死亡病因之一。在過(guò)去的十年中，随著(zhe)影像學(xué)的進(jìn)步以及健康體檢的普及，越來越多的肝癌病人在患病早期被發(fā)現。但由于肝髒捐贈者的短缺，外科肝髒切除術仍然是治療早期肝癌病人的最主要方法。本研究建立了一種(zhǒng)預測早期肝癌病人術後(hòu)複發(fā)的模型。

研究思路

1. CpG位點選擇
研究者首先采用焦磷酸測序技術驗證了450k芯片數據的再現性。通過(guò)分析66例病人的FFPE樣本和新鮮冷凍組織樣本發(fā)現，随機選擇的兩(liǎng)個CpG位點甲基化水平呈現出高度的一緻性。采用△β＞0.15，FDR＜0.01和p value＜0.01這(zhè)一标準，過(guò)濾450K芯片結果，得到2550個差異CpG位點。随後(hòu)，研究者爲了區分高風險和低風險的病人，采用LASSO和SVM-RFE算法分别得到了30個差異最顯著的CpG位點。
2. 探究可預測的标簽
通過(guò)比較兩(liǎng)種(zhǒng)算法得到的CpG位點，發(fā)現有14種(zhǒng)是同時(shí)被鑒定出的，46種(zhǒng)是不同的。通過(guò)分析46種(zhǒng)不同CpG位點，把66例樣本分成(chéng)複發(fā)和不複發(fā)兩(liǎng)個亞類。研究者随後(hòu)采用Cox回歸模型在訓練組中進(jìn)一步縮小了E-HCC病人的甲基化檢測位點。結果發(fā)現，cg20657849（SCAND3）, cg19406367（SGIP1）, 和 cg19931348（PI3）三個甲基化位點與E-HCC病人複發(fā)高度相關。
随後(hòu)研究者采用焦磷酸測序技術，分别在訓練組和鑒定組中量化這(zhè)一發(fā)現。爲了更好(hǎo)的研究這(zhè)三個CpG位點用來預測E-HCC複發(fā)的準确性，在訓練組中設定了一種(zhǒng)危險系數評分。（risk score = (0.104 ×SGIP1甲基化水平) + (-1.125 ×SCAND3甲基化水平) + (-0.085 × PI3甲基化水平)）研究發(fā)現，-0.401爲risk score阈值。
3. 證實這(zhè)一标簽
爲了證實這(zhè)一模型的穩定性，研究者分别在一組内部樣本和兩(liǎng)組外部樣本進(jìn)行了檢測。在内部樣本中，該模型成(chéng)功的分類了68例複發(fā)高風險病人，73例低複發(fā)風險病人。在外部樣本中，同樣成(chéng)功分類了高風險和低風險病人。ROC分析發(fā)現，MSEH預測早期肝癌病人複發(fā)比三個CpG位點單獨檢測更有效。
4. 建立可預測的諾模圖
爲了建立臨床上适用的用來預測個體複發(fā)的模型，綜合考慮了協變量後(hòu)，研究者用諾模圖建立了可以用來預測的模型。基于RFS的多變量分析，研究者生成(chéng)了一個諾模圖預測患者的5年生存率，通過(guò)三個校正點的檢測均得到理想結果。
本文通過(guò)分析早期肝癌患者甲基化芯片結果，得到三個與早期肝癌患者複發(fā)相關的CpG位點，并通過(guò)訓練組和驗證組優化了這(zhè)一預測模式。最終，研究者建立了一種(zhǒng)諾模圖，用來預測早期肝癌患者的術後(hòu)複發(fā)風險。

案例四：甲基化研究揭示鼻咽癌治療新靶點

研究背景

在中國(guó)華南地區，鼻咽癌有較高的發(fā)病率。目前，鼻咽癌病人的治療方案主要取決于病人的TNM分期。但是，約30%的鼻咽癌

甲基化高級分析A. 甲基化與表達譜相關性熱圖，此類型的圖也可展示其他不同組學(xué)的相關性。B. 基因組、轉錄組與甲基化組變異通路圖，可在同一張圖上展示通路中的基因組、轉錄組與甲基化組等不同組學(xué)上的變異，以及多組學(xué)的變異對(duì)通路的影響。C. 關鍵基因的多組學(xué)相關性圖，以相關性圖的形式，同時(shí)展示關鍵基因在基因組、轉錄組與甲基化等多組學(xué)層面(miàn)上的相關性，共變異或甲基化狀态。 

 HYBRIDIZATION 雜交圖中橫軸是log2(信号值)，縱軸是樣本名稱。紅色熒光表示未甲基化位點的log2(信号值)，綠色熒光表示甲基化位點的log2(信号值)。結論：紅色熒光和綠色熒光的差值一般是2個數量級。陽性參照中綠色探針産生的log2(信号值) >12，标記實驗成(chéng)功。  

樣本質控圖橫軸是log2(甲基化中位數值), 縱軸是（非甲基化中位數值），每個樣本的整體甲基化程度一個圓點表示，其在虛線右上角分布則表示達到質控的标準。結論: 本研究全部樣本達到質控的标準。