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全轉錄組測序

目    錄
  • 産品介紹
  • 常見問題
  • 經(jīng)典案例
  • 結果展示

背景簡介
狹義的轉錄組默認隻包含mRNA,但是廣義的轉錄組指的是細胞或組織中所有轉錄産物的集合,其中包含mRNA和非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)。非編碼RNA目前的研究多集中在具有調控功能(néng)的small RNA(以miRNA爲代表),長(cháng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)和環狀RNA(circular RNA, circRNA)上,而這(zhè)幾類ncRNA的調控對(duì)象都(dōu)和mRNA有關。因此,全轉錄組即包含了ncRNAs和mRNA。全轉錄組測序即對(duì)以上四種(zhǒng)ncRNA進(jìn)行測序,并分析這(zhè)四者之間複雜的相互作用關系。

技術優勢
文庫優化:針對(duì)不同長(cháng)度序列采用兩(liǎng)種(zhǒng)文庫構建方法,去核糖體鏈特異性文庫可獲得mRNA、lncRNA和circRNA信息。
數據全面(miàn):全轉錄組測序可獲取4類主要RNA(miRNA,mRNA,lncRNA,circRNA)數據,可對(duì)這(zhè)些數據進(jìn)行标準分析及整合分析
關聯全面(miàn):通過(guò)對(duì)mRNA /miRNA/lncRNA/circRN序列測定及後(hòu)續分析,深入開(kāi)展全轉錄組調控網絡(ceRNA網絡)分析

技術路線

分析内容

樣本類型

細胞,組織,體液、血清、血漿、全血,總RNA等
建議總RNA起(qǐ)始量:>15 μg,濃度≥200 ng/μL

近期用戶文章
1. Sun JC, et al. (2016) A computationally constructed ceRNA interaction network based on a comparison of the SHEE and SHEEC cell lines. Cell Mol Biol Lett 21 (1) :21.
2. Wang Wei, et al. (2017) Identification of miRNA, lncRNA and mRNA-associated ceRNA networks and potential biomarker for MELAS with mitochondrial DNA A3243G mutation. Scientific Reports 7 :41639.

Q1:全轉錄組測序爲什麼(me)需要構建兩(liǎng)個文庫?
A:全轉錄組測序需要構建2個測序文庫,一個小RNA文庫和一個去除核糖體RNA的鏈特異性文庫,然後(hòu)分别上機測序。小RNA長(cháng)度較短,一般小于50nt,采用測序策略爲50SE。其他三類RNA序列一般大于200,通常在1000以上,最高可達幾萬,通過(guò)片段化構建150PE測序文庫。最後(hòu)小RNA文庫可以獲得miRNA序列信息,去核糖體的鏈特異性文庫可以獲得mRNA、lncRNA和circRNA的序列信息。

Q2:什麼(me)是ceRNA調控網絡(ceRNA networks)?
A:一些非編碼RNA,如lncRNA和circRNA等會(huì)競争結合miRNA,導緻miRNA調控的靶基因發(fā)生變化。這(zhè)類新型的非編碼RNA除了轉錄前調控等功能(néng)外,一個重要的功能(néng)就(jiù)是像海綿一樣對(duì)miRNA有吸附作用。這(zhè)種(zhǒng)具有miRNA吸附作用的RNA,我們稱作内源性競争結合RNA(Competitive endogenous RNA, ceRNA),具體的相互作用關系如下圖:

circular RNA(HRCR)靶标結合miR-223保護心髒免受心肌肥厚和心髒衰竭

本研究中作者首先通過(guò)miRNA基因芯片分析、Northern blot、RT-PCR等技術手段發(fā)現,ISO處理14天後(hòu),miRNA-223的表達量顯著上調,并且在患有心髒肥厚和心髒衰竭的人和小鼠心髒中miRNA-223的表達量也有明顯的上調,初步得出結論:miRNA-223參與調控心肌肥厚和心髒衰竭。接下來作者利用miR-223過(guò)表達轉基因小鼠以及miR-223基因敲除轉基因小鼠進(jìn)一步驗證表型,結果發(fā)現miR-223過(guò)表達小鼠成(chéng)年後(hòu)出現明顯的心肌肥厚和心髒衰竭症狀,而miR-223基因敲除小鼠表型相反,進(jìn)一步證明在活體内,miR-223可以誘導心肌肥厚和心髒衰竭。

接下來作者進(jìn)一步研究miR-223對(duì)心肌細胞的影響,結果發(fā)現miR-223過(guò)表達細胞中出現明顯的心肌肥大反應,而miR-223敲除細胞中,ISO處理引起(qǐ)的心肌肥大反應明顯被破壞,說(shuō)明miR-223過(guò)表達會(huì)促進(jìn)心肌肥厚,而miR-223基因敲除會(huì)阻斷心肌肥厚。


爲了進(jìn)一步研究miR-223調控心肌肥厚和心髒衰竭的分子機制,作者篩選了一些參與調控心肌肥厚的基因作爲miR-223的靶标候選基因,然後(hòu)通過(guò)western blot分析miR-223過(guò)表達和缺失突變體中上調以及下調的基因,結果發(fā)現miR-223可以顯著抑制ARC的表達,而前人已經(jīng)有研究報道(dào)ARC參與調控心肌肥厚和細胞凋亡,所以初步推斷ARC可能(néng)是miR-223下遊的靶标位點。
接下來作者通過(guò)RNAhybrid分析發(fā)現,ARC的3′UTR含有潛在的miR-223的結合位點,然後(hòu)通過(guò)Target Protector technology進(jìn)一步證明miR-223可以特異調控ARC的表達,ARC 3′UTR的翻譯活性受到miR-223的抑制。
接下來作者構建了一個不帶ARC 3′UTR的腺病毒載體,這(zhè)種(zhǒng)病毒載體對(duì)miR-223不敏感,結果發(fā)現這(zhè)種(zhǒng)腺病毒可以減弱ISO處理誘導的心肌肥厚反應。然後(hòu)作者通過(guò)ARC過(guò)表達轉基因株系進(jìn)一步證明了ARC可以保護心髒免受心肌肥厚和心髒衰竭,減少細胞凋亡。以上這(zhè)些研究結論表明:在調控心肌肥厚和心髒衰竭的過(guò)程中,ARC是miR-223的下遊靶标位點。


CircRNA和miRNA的互作是目前研究的一個熱點話題,爲了進(jìn)一步研究是否有CircRNA參與調控miR-223的表達,作者從CircRNA數據庫中随機篩選出100個CircRNA,通過(guò)qRT-PCR驗證篩選到36個CircRNA,然後(hòu)通過(guò)Northern blot篩選到一個特異性表達的CircRNA: mm9-circ-012559(HRCR)。
然後(hòu)作者通過(guò)RNAhybrid分析發(fā)現HRCR包含6個CircRNA的靶标結合位點,初步表明HRCR可以和miR-223結合。接下來作者通過(guò)生物素标記,qRT-PCR,Northern bolt,pull down assay、熒光原位雜交(FISH)等技術手段,從正向(xiàng)以及反向(xiàng)兩(liǎng)個角度分别驗證HRCR和miR-223之間的互作關系,結果發(fā)現miR-223和HRCR在細胞質中存在共定位現象,HRCR可以直接結合到miR-223上。

HRCR和miR-223存在互作,而miR-223可以通過(guò)調控下遊ARC的表達,進(jìn)而調控心肌肥厚和心髒衰竭,爲了進(jìn)一步研究HRCR對(duì)ARC表達的影響,作者構建了HRCR過(guò)表達載體和基因敲除突變體,結果發(fā)現HRCR過(guò)表達載體中,ARC的表達量和活性顯著增加,HRCR敲除突變體中,ARC的表達量和活性顯著降低,并且HRCR可以消除miR-223對(duì)ARC表達的抑制作用,說(shuō)明HRCR可以通過(guò)調控miR-223以及ARC的表達,進(jìn)而調控心肌肥厚。

參考文獻
Wang K, Long B, Liu F, et al. A circular RNA protects the heart from pathological hypertrophy and heart failure by targeting miR-223.[J]. European Heart Journal, 2016, 37(33):2602-2611.

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