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宏轉錄組學(xué)

目    錄
  • 産品介紹
  • 常見問題
  • 經(jīng)典案例
  • 結果展示

背景簡介

宏轉錄組學(xué)是在轉錄水平,以特定樣本中微生物群落的全部轉錄本爲研究對(duì)象,分析微生物群落的基因表達與調控。宏轉錄組測序,避開(kāi)了微生物的分離培養,爲研究人員提供了從整體水平研究特定環境,特定時(shí)期微生物群落基因組轉錄情況以及轉錄調控規律的高效工具。

技術優勢

樣本處理個性化:由于微生物樣本組成(chéng)複雜,將(jiāng)根據不同樣本特點,針對(duì)性進(jìn)行樣本處理和文庫制備。
數據分析優化:精選數據拼接軟件,最大程度獲取微生物群落基因組轉錄信息。
注釋全面(miàn):采用最新版數據庫,更精确地注釋和分析微生物群落基因表達信息。
跨組學(xué)分析:從宏基因組到宏轉錄組,多個角度解析微生物群落結構與功能(néng)。

技術路線

分析内容

樣本類型

樣本類型:培養的細菌(≥ 5×106),組織,環境樣品,總RNA等
RNA總量:≥ 5 μg,濃度:≥50ng  
OD值:260/230≥1.5;260/280≥1.8
完整性(bioanalyzer2100):RIN值≥7,28S/18S≥0.7,或者峰型銳利,模拟電泳圖無彌散,5S峰顯示正常的樣品

Q1:對(duì)于小型動物,如果采樣時(shí)不能(néng)分離腸道(dào)和腸道(dào)内容物,宿主對(duì)宏轉錄組的影響很大,這(zhè)種(zhǒng)情況下,需要如何解決?

A:對(duì)于這(zhè)種(zhǒng)問題可以從以下兩(liǎng)個方面(miàn)進(jìn)行解決:
1.在實驗建庫過(guò)程中去除宿主污染(比如宏轉錄組中用去polyA法去除宿主mRNA);
2.另一種(zhǒng)更直接的方法是,加大測序數據量,通過(guò)與宿主基因組比對(duì)去除宿主污染,但該方法前提是需要有宿主參考基因組,如果宿主沒(méi)有參考基因組,當污染很高的情況下,基本上沒(méi)有辦法去除宿主污染。

Q2:宏轉錄組測序完成(chéng)後(hòu)是否需要驗證?是用qPCR方法驗證嗎?
A:如果是群落水平的驗證,qPCR可以作爲一個考慮的方法。但是宏轉錄組的微生物含量非常不穩定,qPCR不一定具有代表性。最好(hǎo)的辦法是找到基因的菌落歸屬,然後(hòu)做一些單細菌克隆驗證。

Q3:如果不做宏基因組測序實驗,那是不是也沒(méi)有做宏轉錄組測序的必要?
A:宏轉錄組和宏基因組關注的點不一樣,宏轉錄組在建庫中可能(néng)會(huì)去掉一些RNA或者功能(néng)分析,但是實際上宏轉錄組相關的文章很多,因此不需要擔心這(zhè)個問題。

宏基因組和宏轉錄組聯合分析綿羊瘤胃中微生物與甲烷産量的關系

反刍動物是單一且最大的人爲溫室氣體甲烷來源的代表。甲烷由反刍動物消化道(dào)中的産甲烷古菌産生。雖然相同品種(zhǒng)的單個動物之間甲烷産量的差異已被觀察到,這(zhè)種(zhǒng)變化的依據仍有待闡明。爲探索這(zhè)種(zhǒng)甲烷産量的機理,研究人員測定了22隻綿羊的甲烷産量,結果揭示甲烷産量具有可重複、可量化的特征。宏基因組和宏轉錄組測序證實,甲烷排放量高和低的綿羊都(dōu)具有類似的産甲烷菌豐度和甲烷生成(chéng)途徑基因。然而,對(duì)于甲烷排放量高的綿羊,産甲烷途徑基因的轉錄大幅增加。鑒定出一組瘤胃産甲烷菌,這(zhè)些産甲烷菌的甲烷生成(chéng)途徑轉錄譜與甲烷産量相關。上圖爲瘤胃産甲烷菌進(jìn)化分析。

參考文獻
W Shi,et al. (2014)Methane yield phenotypes linked to differential gene expression in the sheep rumen microbiome. Genome Research. doi/10.1101/gr.168245.113
 

樣本物種(zhǒng)豐度柱狀圖
根據物種(zhǒng)注釋結果及豐度統計,默認選取各分類水平(界門綱目科屬種(zhǒng))豐 度最高的20個物種(zhǒng),進(jìn)行樣品豐度柱狀圖的繪制,該柱狀圖以堆疊柱狀圖 (stacked bar chart)形式展現, 便于更直觀地進(jìn)行樣品間物種(zhǒng)豐度的比較。 在各個層級中,可以直觀的看到優勢菌種(zhǒng)的表達情況及在各個不同處理 中的變化趨勢。


KEGG注釋統計根據KEGG注釋總表,可以對(duì)KEGG注釋的總體情況進(jìn)行Unigene數目的統計。

抗生素耐藥基因注釋CARD全稱是Comprehensive Antibiotic Resistance Database,目前該數據庫 仍在不斷地更新,該數據庫以ARO(Antibiotic Resistance Ontology)爲核心對(duì)耐藥性數據進(jìn)行整理,以達到數據實時(shí)更新的效果。通過(guò)對(duì)Unigene進(jìn)行對(duì) 應的抗生素耐藥性注釋,并統計抗生素耐藥功能(néng)的豐度。

eggNOG功能(néng)注釋eggNOG是一個用于同源聚類基因群注釋的專業數據庫,它包括來自原始COG/KOG的功能(néng)分類,以基于分類學(xué)的功能(néng)注釋。

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