腺相關病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成(chéng)員之一，是一類無法自主複制、無被膜的二十面(miàn)體微小病毒，其直徑約20-26nm，含有4.7kb左右的線狀單鏈DNA作爲基因組。研究中采用的重組腺相關病毒載體（Recombination adeno-associated virus, rAAV）是在非緻病的野生型AAV基礎上改造而成(chéng)的基因載體，由于其種(zhǒng)類多樣、免疫原性極低、安全性高、宿主細胞範圍廣（對(duì)分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能(néng)力）、擴散能(néng)力強、體内表達基因時(shí)間長(cháng)等，rAAV被視爲最有前途的基因研究和基因治療載體之一。
AAV基因組及其編碼的蛋白（圖1）
1）rAAV包裝與純化
AAV病毒包裝過(guò)程中，包裝質粒負責編碼目的基因以及兩(liǎng)個末端反向(xiàng)重複序列（ITR，對(duì)于病毒的複制和包裝具有決定性作用），輔助質粒包含AAV包裝所需的 （編碼病毒衣殼蛋白）和 （參與病毒的複制）基因，以及腺病毒Helper質粒。三種(zhǒng)質粒共同轉染293T細胞後(hòu)，AAV病毒開(kāi)始複制和包裝。聯川生物合作公司和元上海腺相關病毒的生産和質控采取了國(guó)際學(xué)術界公認的标準流程，采用三質粒系統在293T細胞中進(jìn)行包裝，共轉染後(hòu)通過(guò)對(duì)細胞裂解物進(jìn)行密度梯度離心純化和收集病毒。
rAAV包裝及純化
rAAV滴度檢測
檢測方法：定量PCR檢測病毒基因組中外源DNA拷貝數
實驗原理：腺相關病毒的基因組爲單鏈DNA，外源DNA拷貝數代表病毒基因組拷貝數
2） rAAV侵染細胞過(guò)程
純化後(hòu)的AAV病毒載體可以用于侵染細胞，侵染細胞時(shí)，AAV與細胞表面(miàn)特異性受體結合，激活胞内信号通路，進(jìn)而觸發(fā)受體介導的AAV通過(guò)受體介導的内吞作用進(jìn)入細胞，在核内體（Endosome）、高爾基體等細胞器的協助下進(jìn)入細胞核，随後(hòu)病毒裂解，其單鏈DNA需複制成(chéng)爲雙鏈DNA後(hòu)表達目的基因。
腺相關病毒作用機制
3） AAV特點
1、 安全性高、免疫原性低：AAV是一種(zhǒng)複制缺陷型DNA病毒，無自主複制能(néng)力，野生型AAV依賴rep基因進(jìn)行低頻定點整合，rAAV不整合。目前尚無由AAV引起(qǐ)的人類及哺乳動物疾病報道(dào)，也是FDA批準上市的基因治療藥物中最安全的病毒載體之一。
2、 宿主細胞範圍廣：AAV具有廣泛的宿主範圍，對(duì)分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能(néng)力。
3、 擴散能(néng)力強：AAV直徑約20-26nm，體積小，滴度高，具有良好(hǎo)的擴散能(néng)力，其中AAV-PHP.eB和AAV9具有跨血腦屏障的能(néng)力，在神經(jīng)科學(xué)領域應用廣泛。
4、 體内表達基因時(shí)間長(cháng)：AAV具有保持長(cháng)期基因轉錄表達能(néng)力，體内表達一般3周可以達到高峰，随後(hòu)持續表達，作用時(shí)間＞5個月。
5、 載體容量小： 由于AAV的體積小，其是實驗室常見病毒載體系統中裝載量最小的。AAV的兩(liǎng)個ITR之間所能(néng)容納的最大序列長(cháng)度是4.7 kb。
6、 種(zhǒng)類多樣：AAV血清型衆多，此外，根據不同的實驗設計，我們還(hái)在不斷的突變，篩選新的血清型（AAV1-13，AAV2/1, 2/2, 2/5, 2/6, 2/8, 2/9, DJ; retro, PHP.eB…）。
目前已注冊的AAV種(zhǒng)類總數已超過(guò)196種(zhǒng)，靈長(cháng)類動物體内有13種(zhǒng)不同血清型的AAV（即AAV1-AAV13），其中AAV2、AAV3、AAV9源自人類本身，值得注意的是，AAV2是最早被克隆的病毒，也是迄今研究最爲徹底、應用最爲廣泛的病毒載體。随著(zhe)研究的不斷深入，研究人員發(fā)現不同血清型的AAV之間可以雜交，而雜交後(hòu)的AAV會(huì)兼有雜合雙方的特點，因此，AAV亞型順勢誕生。
現在研究中常用的rAAV就(jiù)是利用AAV2型基因組與不同的衣殼蛋白結合産生的混合體病毒載體，一般标記爲rAAV2/N (N爲不同的衣殼血清型)。重組的病毒具有AAV2型的穩定表達和基因整合能(néng)力，同時(shí)獲得了不同血清型的組織感染嗜親性（不同血清型衣殼表面(miàn)的特定結構位點決定了各自受體的特異性），表現出一定的器官靶向(xiàng)特異性（表1）。
表1 不同血清型AAV的組織嗜親性
小建議：如您不确定選擇哪種(zhǒng)血清型，可嘗試使用和元上海Pandora’s Virus （AAV試用裝）進(jìn)行預實驗，通過(guò)比較不同血清型對(duì)目标組織的感染效果，摸索最佳實驗條件（注射方法、注射位點、病毒用量等），以便得到更理想的實驗結果。
基于上述特點，AAV被視爲是一種(zhǒng)高效和安全的體外及體内基因轉導工具。尤其在整體水平研究中，與其他常用病毒工具載體相比，AAV具有感染過(guò)程溫和長(cháng)效的表達能(néng)力，而成(chéng)爲基因操作的利器（表2）。
表2 不同病毒的生物學(xué)特性比較
4） AAV應用案例
1、 廣譜及特異性
表3 常用啓動子列表
1.1 廣譜啓動子
客戶發(fā)表文章：EMBO Rep. (IF= 8.749). Li XG,et.al. (2019). Tau accumulation triggers STAT1-dependent memory deficits by suppressing NMDA receptor expression. [腺相關病毒, AD, 過(guò)表達，幹擾]
注射部位：小鼠海馬CA3區
載體：AAV-CMV-Y701F-STAT1-RFP&AAV-CMV-hTau-EGFP
病毒滴度：5 × 1012 VG/mL&1.13 × 1013 VG/mL
觀察時(shí)間：1個月
1.2 特異性啓動子
客戶發(fā)表文章：Nature Neuroscience. (IF=19.912). Li YD,et.al. (2017). A distinct entorhinal cortex to hippo-campal CA1 direct circuit for olfactory associative learning. [腺相關病毒, 學(xué)習與記憶, 光遺傳]
注射部位：小鼠LEC區
載體：AAV-CaMKIIα-eNpHR3.0-EYFP
病毒滴度：2× 1012 VG/mL
觀察時(shí)間：1個月
AAV病毒載體配合特異性啓動子的選擇，可實現部分細胞類型的特異性表達; 此外，借助Cre鼠（Cre-LoxP系統），利用AAV攜帶的DIO結構可高精度靶向(xiàng)特異類型神經(jīng)元。
1.3 依賴Cre鼠特異性表達
客戶發(fā)表文章：PNAS. (IF=9.674). Du H,et.al. (2016). Dopaminergic inputs in the dentate gyrus direct the choice of memory encoding. [腺相關病毒, 學(xué)習與記憶, 光遺傳]
注射部位：TH-Cre小鼠VTA
載體：AAV-DIO-ChR2-mCherry
病毒滴度：1× 1013 VG/mL
注射體積：500nl
觀察時(shí)間：1個月
2、在神經(jīng)科學(xué)領域中的應用
2.1 外側缰核&光遺傳學(xué)
客戶發(fā)表文章：Nature. (IF=41.577). Yang Y,et.al. (2018). Ketamine blocks bursting in the lateral habenula to rapidly relieve depression. [腺相關病毒, 抑郁症, 光遺傳]
注射部位：小鼠LHb
載體：AAV2/9-hSyn-oChIEF-tdTomato
血清型：AAV2/9
病毒滴度：6.29× 1012 VG/mL
注射體積：100nl
觀察時(shí)間：1個月
2.2 臂旁核&化學(xué)遺傳學(xué)
客戶發(fā)表文章：Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺相關病毒, 癢, 光遺傳,化學(xué)遺傳]
注射部位：小鼠PBN
載體：AAV-hSyn-HA-hM4Di-IRES-mCitrine
血清型：AAV2/9
病毒滴度：1.0× 1013 VG/mL
注射體積：150nl
觀察時(shí)間：3周
2.3 丘腦&鈣離子成(chéng)像
客戶發(fā)表文章：客戶發(fā)表文章：Science. (IF=41.058). Ren S,et.al. (2018). The paraventricular thalamus is a critical thalamic area for wakefulness. [腺相關病毒, 覺醒]
注射部位：小鼠PVT
載體：AAV-CaMKIIα-GCaMP6f
注射體積：100nl
觀察時(shí)間：4周
2.4 丘腦室旁核&殺死神經(jīng)元
客戶發(fā)表文章：Science. (IF=41.058). Ren S,et.al. (2018). The paraventricular thalamus is a critical thalamic area for wakefulness. [腺相關病毒, 覺醒]
注射部位：小鼠PVT
載體：AAV-CaMKIIα-Cre-GFP &AAV-DIO-caspase-3
注射體積：兩(liǎng)支病毒1:1混合注射100nl
觀察時(shí)間：4周
2.5 海馬、皮層&逆向(xiàng)非跨突觸（rAAV2-retro）
客戶發(fā)表文章：Biological Psychiatry. (IF=11.984). Bing Xing Pan,et.al. (2018). Chronic stress causes projection-specific adaptation of amygdala neurons via SK channel downregulation. [腺相關病毒, 焦慮症, 光遺傳]
注射部位：小鼠dmPFC、VHPC
載體：AAV2/1-retro-Syn-eYFP-Cre、AAV2/8-CaMKIIα-DO-SK2&AAV2/8-CaMKIIα-DIO-SK2-mCherry
注射體積：300nl
觀察時(shí)間：4周
2.6 初級運動皮層&順向(xiàng)跨突觸（rAAV2/1）
Nature Neuroscience. (IF=19.912). Yao J,et.al. (2018). A corticopontine circuit for initiation of urination. [腺相關病毒, 神經(jīng)環路]
注射部位：小鼠皮層M1、PMC
載體：rAAV2/1-hSyn-Cre&rAAV2/9-DIO-hChR2(H134R)-mCherry、rAAV2/9-DIO-GCaMP6s
病毒滴度：rAAV2/1: 5 × 1012 VG/mL；rAAV2/9-DIO-hChR2：1.2 × 1013 VG/mL；rAAV2/9-DIO-GCaMP6s：0.5 × 1012 VG/mL
注射體積：多點注射，每位點30-40nl
觀察時(shí)間：4周
2.7 邊緣前皮質&跨突觸示蹤（WGA-Cre）
客戶發(fā)表文章：Science Advances. (IF=11.511). Ping Zheng,et.al. (2019). Crucial role of feedback signals from prelimbic cortex to basolateral amygdala in the retrieval of morphine withdrawal memory. [腺相關病毒, 成(chéng)瘾, AAV1, AAV-WGA-Cre]
注射部位：小鼠PrL
載體：AAV-hSyn-mCherry-IRES-WGA-Cre
病毒滴度：4.28 × 1012 VG/mL
注射體積：300nl
觀察時(shí)間：4周
2.8 全腦表達&跨血腦屏障（AAV-PHP.eB）
注射方式：尾靜脈注射
載體：pAAV-CMV-mScarlet-3FLAG& pAAV-CMV-mNeonGreen-3FLAG
血清型：AAV-PHP.eB
病毒滴度：1.10×1013 VG/mL&2.35×1013 VG/mL
注射體積：200nl（注射病毒總量：1.5×1013 VG）
觀察時(shí)間：3周
3、 皮層&AAV幹擾（AAV-shRNA）
客戶發(fā)表文章：Nature Medicine. (IF=22.864). Cao X,et.al. (2013). Astrocyte-derived ATP modulates depressive-like behaviors.[腺相關病毒, 抑郁症]
注射部位：小鼠mPFC
載體：AAV-CMV-P2rx2 shRNA-EGFP
病毒滴度：~3× 1012 VG/mL
注射體積：1.5ul
觀察時(shí)間：2周
4、 AAV稀疏标記
應用文獻：Luo WS, et al., (2016) Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Sci Rep.
載體信息：pAAV-PTRE-tight-NLS-Cre（108-109VG/mL）、pAAV-EF1a-DIO(tTA-P2A-mScarlet)-WPRE（1012VG/mL）
5、在視網膜中的應用
玻璃體腔注射 玻璃體腔：AAV-syn-GcaMP6s
6、在肝髒中的應用
客戶文章：FASEB Journal. (IF=5.391). Yang Y,et.al. (2018). Long-term exercise prevents hepatic steatosis: a novel role of FABP1 in regulation of autophagy-lysosomal machinery. [非酒精性脂肪肝，自噬溶酶體，腺相關病毒過(guò)表達]
注射方式：尾靜脈
載體：AAV8-TGB-Fabp1
血清型：rAAV2/8
注射體積： 200nl（病毒總量5×1011 VG）
觀察時(shí)間：1周
7、 在肺部中應用
AAV-LUNG感染肺部結果
7、 在胰腺中的應用
AAV-PAN感染結果
