以高通量測序爲代表的現代分子生物學(xué)技術的突飛猛進(jìn)，正在對(duì)傳統的醫學(xué)檢驗産生影響，目前已在無創産前篩查、染色體拷貝數變異篩查、遺傳病緻病位點篩查、胚胎植入前診斷等臨床檢驗中心應用。随著(zhe)國(guó)家食品藥品監督管理局接連批準基于高通量測序技術（NGS），以及伴随診斷标準審批的多基因腫瘤突變聯合檢測試劑盒，illumina的儀器也在前幾天獲批，NGS已經(jīng)成(chéng)爲醫學(xué)檢測領域不可忽視的重要技術。
不同于往常的檢測手段，從樣本處理到檢測結果，NGS存在諸多繁雜的步驟。隻有保證檢測結果的準确性，臨床應用才能(néng)落到實處。在NGS實驗室的管理體系上不斷優化，力求打造管理科學(xué)化，操作規範化，方法标準化及體系國(guó)際化的實驗室，是該行業大家最關心的話題。今天我就(jiù)結合在工作中踐行的實際情況，淺談“5M1E”分析法在NGS實驗室管理中的應用。
“5M1E”其實就(jiù)是對(duì)全面(miàn)質量管理理論中六個影響産品質量的主要因素的簡稱，是指6種(zhǒng)分析維度與方法，其中五項的英文是以M開(kāi)頭，一項是以E開(kāi)頭，分别爲：“5M”：Man（人），Machine（機），Material（料），Method（法），Measurement（測）；“1E”：Environment（環）。
一、 人
人員是NGS實驗室管理中最活躍的因素，對(duì)實驗室的全部活動起(qǐ)著(zhe)主導和支配作用，是決定實驗室檢測質量的根本因素。
1、 專業與能(néng)力：因二代測序實驗操作的複雜性，對(duì)NGS檢驗人員的要求不能(néng)僅僅停留在簡單進(jìn)行儀器操作這(zhè)個層面(miàn)上。爲保證檢驗結果的快速、準确，檢驗人員不但要熟練掌握各種(zhǒng)儀器的操作，更要了解可能(néng)影響檢驗結果的全方位因素，檢驗人員在技能(néng)方面(miàn)必須有分子生物學(xué)的專業知識和技術能(néng)力。
2、 教育與培訓：人員的培訓在保證檢驗質量中尤爲重要，從事(shì)二代測序的檢驗人員在上崗前必須先取得臨檢中心《臨床基因擴增實驗室技術人員培訓合格證》和NGS技術的理論與技能(néng)培訓。分析人員需要經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)的培訓。
3、 專才到全才：爲了讓檢驗人員可以在保證質量的前提下快速上崗，可以將(jiāng)NGS實驗室崗位進(jìn)行細分，如收樣、提取、建庫、質檢純化、上機測序等，先按單崗進(jìn)行培訓考核上崗，定崗定區域，等熟練後(hòu)再進(jìn)行全方位培訓，這(zhè)樣有助于實驗室人員的安排，也有助于檢測結果的準确性。
二、 機
這(zhè)裡(lǐ)是指直接或間接用于檢測分析的，對(duì)檢測結果有影響的儀器設備及有關輔助性儀器設備等，這(zhè)裡(lǐ)包含了測序後(hòu)數據分析軟件。
1、 儀器設備的校準與确認：對(duì)于檢測設備，經(jīng)過(guò)采購、到貨驗收、安裝調試等過(guò)程後(hòu)，首先在設備投入使用前進(jìn)行校準或驗證确認，确保用于檢測的設備及其軟件達到檢測的準确度和規範性。當校準報告給出一組修正因子時(shí)，需要將(jiāng)其校準因子在實際中正确運用，否則會(huì)有儀器偏差引入。
2、 數據分析軟件：這(zhè)是NGS實驗室特有的環節，實驗室需要用商品試劑配套的軟件進(jìn)行數據分析，并确認使用軟件的版本和數據庫的現行有效版本；數據需要專業的生信人員進(jìn)行分析，需要在數據預處理、數據比對(duì)、數據質控、分析判斷等每個流程進(jìn)行質控，确保數據分析的準确性。
3、 儀器的配套使用：需要使用商品試劑申報時(shí)的配套儀器型号，如燃石人EGFR/ALK/BRAF/KRAS 基因突變聯合檢測試劑盒（可逆末端終止測序法）受理号爲CSZ1700157，配套儀器爲Illumina 公司生産的MiSeqDx，雖然Illumina公司有MiSeq、MiniSeq、NextSeq500等不同型号的測序儀，但在檢測過(guò)程中必須選用MiSeqDx型号的儀器，否則儀器之間的差異會(huì)影響檢測結果的準确性。
4、 設備的标識：設備标識是設備管理過(guò)程中非常重要的一個環節，設備要有一個唯一性編号的标識，這(zhè)個編号是唯一性的，即使是同樣型号的儀器也不允許重複，隻有這(zhè)樣才能(néng)做到檢測數據的溯源性要求。還(hái)有設備的運行、維修、暫停等狀态也需要做好(hǎo)标識，防止設備的非預期使用影響到檢測結果。
5、 設備的維護和保養：設備要定期做好(hǎo)維護和保養，一般校準和驗證的周期爲1年，中間可以采用标準物質或同型号設備進(jìn)行比對(duì)，确保設備的性能(néng)，保證結果的準确性。如設備有大的關鍵零件的維修更換、精密儀器的位置搬動等，需要對(duì)設備的性能(néng)重新進(jìn)行驗證确認。如測序儀等設備對(duì)外界環境有溫濕度要求的，要确保環境符合要求，并做好(hǎo)監控和記錄，否則外界環境對(duì)檢測結果也會(huì)存在影響。
三、 料
這(zhè)裡(lǐ)是指不局限于實驗室的試劑和耗材，還(hái)包含檢測的樣本，檢測記錄和報告。
1、 樣本：要确保NGS檢測結果的準确性，樣本的質量起(qǐ)著(zhe)關鍵性的決定作用，實驗室應制定正确采集處理原始樣品、标識及樣品質檢标準的文件化程序。
1.1 采集活動前的指導：如采集的方法、影響采集方法的因素，樣本采集的類型和量、樣本存儲的容器和必需添加物。
1.2 采集活動的指導：采集患者身份的确認，采集樣本的原始标識，采集時(shí)間等。
1.3 樣品的存儲和标識：從樣品接收開(kāi)始直到報告出具，樣品存儲溫度的要求、使用的保存液等，在整個實驗室流轉過(guò)程中都(dōu)具有唯一性标識，防止混淆。除了樣本本身的區别标識，還(hái)應該有樣品的狀态标識，如待檢、檢測中、已檢三種(zhǒng)狀态，分别存放在不同的區域中。
1.4 制定樣本的質檢标準：如石蠟包埋(FFPE)的非小細胞肺癌(NSCLC)組織樣本，腫瘤細胞含量應達20%以上，提取的DNA量應大于50ng才能(néng)開(kāi)始NGS的下一步檢測。如樣本質檢不合格需要重新進(jìn)行采樣，如不進(jìn)行樣本的質檢直接進(jìn)入下一道(dào)工序，到最後(hòu)發(fā)現檢測結果不符合要求，耗時(shí)又耗錢，耽誤患者用藥時(shí)間。
2、 試劑
實驗室應制定用于試劑的接收、驗收、使用、存儲的文件，試劑到貨時(shí)進(jìn)行外觀及性能(néng)的進(jìn)貨驗收，按照存儲溫度及批号規則進(jìn)行試劑的存放，按照批号、效期的原則錄入到系統并做好(hǎo)庫存卡，試劑領用做到先進(jìn)先出。商品化試劑在用于臨床樣本檢測應進(jìn)行有效的性能(néng)驗證（如準确性、靈敏度、特異性）。
NGS的商品試劑因都(dōu)是低溫保存，一般都(dōu)會(huì)有開(kāi)瓶有限期和反複凍融次數要求，實驗室在使用過(guò)程中需要及時(shí)記錄開(kāi)瓶日期和凍融次數，使用時(shí)可根據需要進(jìn)行分裝，避免反複凍融。若分裝後(hòu)的物料需要繼續保存，則應注明物料名稱、原瓶開(kāi)瓶日期、分裝日期等信息，确保試劑的可靠性。
3、 耗材
NGS實驗室都(dōu)會(huì)用到各種(zhǒng)規格的移液器槍頭、PCR管、離心管等一次性耗材，市場上有衆多的廠家及規格型号，在NGS實驗過(guò)程中請确保使用無菌、濾芯、低吸附的規格型号；同時(shí)确保無脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。
4、 記錄和報告
記錄和報告也是一種(zhǒng)特殊的物料，記錄設計要有檢測樣本、使用的設備編号、使用的試劑批号、檢測日期、檢測人、複核人、檢測結果的原始數據等信息，方便追溯。每個實驗環節需要及時(shí)、準确、真實填寫各種(zhǒng)記錄，定期整理歸檔管理。檢測報告内容應包含但不局限于患者人員信息、病曆信息、樣本信息、所用試劑和分析軟件信息、檢測結果及解釋，報告人及有簽發(fā)報告資質人員的簽名。報告應簡潔扼要、通俗易懂。
四、 法
爲了使NGS實驗規範管理，操作标準統一，保證檢測結果的準确性，需要制定各種(zhǒng)程序性文件、作業指導書、記錄表單，文件保持現行有效版本，方便員工随時(shí)取閱，做到“有法可依、有法必依、執法必嚴、違法必究”。
1、 程序性文件：可以參照CNAS-CL02:2012《醫學(xué)實驗室質量和能(néng)力認可準則》的要素建立實驗室管理的質量手冊和程序性文件。
2、 操作性規程：可以采用圖文并茂的方式建立實驗操作細節、設備操作規程、質控方法及質控标準等。
3、 記錄表單：可以根據NGS的工序如收樣、提取、建庫、純化、上機測序各工序形成(chéng)全套的實驗操作記錄；另外如設備使用、維護、保養記錄、溫濕度監控記錄、試劑的配置記錄等配套的各類表單，均由質量部受控發(fā)放使用。
五、 測
爲了提高檢測結果準确性和可靠性所采取的有關措施和活動。
1、 實驗室間質評（EQA）：也叫(jiào)室間質量評價，是國(guó)家衛健委利用各實驗室間的比對(duì)來确定實驗室能(néng)力的活動，實際上它是指爲确保實驗室維持較高的檢測水平而對(duì)其能(néng)力進(jìn)行考核、監督和确認的一種(zhǒng)驗證活動。這(zhè)是NGS實驗室證明自己能(néng)力的一種(zhǒng)很好(hǎo)的方式，也是自己實驗室技術能(néng)力在行業中展示的一個窗口，應該積極報名參加。
2、 實驗室間比對(duì)：實驗室間比對(duì)是按照預先規定的條件，由兩(liǎng)個或多個實驗室對(duì)相同或類似的測試樣品進(jìn)行檢測的組織、實施和評價，從而确定實驗室能(néng)力、識别實驗室存在的問題與實驗室間的差異，是判斷和監控實驗室能(néng)力的有效手段之一。
3、 人員比對(duì)：爲了提高自己實驗室人員的技能(néng)，建議定期開(kāi)展人員比對(duì)活動，這(zhè)是維持和提高檢驗人員能(néng)力水平的一種(zhǒng)很好(hǎo)的手段。倡導實驗室形成(chéng)你追我趕的氛圍，不斷提升實驗人員的技能(néng)。
4、 盲樣測試：能(néng)直接反映實驗室的儀器設備和技術水平，可以作爲實驗室技術人員轉正考核的一種(zhǒng)手段。
5、 陽性對(duì)照和陰性對(duì)照：每次檢測都(dōu)必須放置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，作爲最終判斷結果的參考依據。陰性質控品(NC)的檢測結果應爲陰性，若其中有突變檢出，說(shuō)明環境中可能(néng)存在DNA污染源。陽性質控品(PC)的檢測結果應爲某個基因突變對(duì)應陽性，如果突變未檢出，說(shuō)明試劑盒性能(néng)不理想或操作過(guò)程有誤，此次檢測結果無效。
六、 環
這(zhè)裡(lǐ)是指檢測過(guò)程中的實驗室硬件環境。
1、 實驗室設計布局：NGS實驗室設置應該嚴格按照國(guó)家衛健委高通量測序實驗室的要求進(jìn)行，申請臨床基因擴增檢驗實驗室驗收，标準化分區及空氣流向(xiàng)，确保工作有序，互不幹擾，防止污染。
一般腫瘤領域二代測序分爲試劑準備區、樣本與文庫制備區、DNA打斷區、雜交捕獲區（擴增一區）、文庫擴增區（擴增二區）、文庫檢測區、測序區、電泳區共八個區，每個房間壓差依次梯度≥5Pa，設置PCR專用走廊和緩沖間，在緩沖間内，可設置正壓，使室内空氣不流向(xiàng)室外，室外空氣不流向(xiàng)室内。嚴格人流物流分開(kāi)，嚴格遵守從一區到八區的單一方向(xiàng)制度，不得反向(xiàng)進(jìn)入前一個區，盡量減少在實驗區内不必要的走動，以減少交叉污染。
2、 區域管理：在各個實驗區使用帶有明顯區别标志的工作服和物品（如不同顔色），每個工作區域均有專用的儀器設備，各區域儀器設備須有明确的标記，避免設備物品如加樣器等從其各自的區域内移出。當工作人員離開(kāi)時(shí)，不得將(jiāng)本區的工作服、手套、口罩和物品帶到其他區域，從而造成(chéng)不同的工作區域間設備物品發(fā)生混淆污染。
3、 環境衛生：每個區域都(dōu)應該有獨立的清潔工具，每個區域的清潔工具不得混用，清潔時(shí)按照從一區到八區的單一方向(xiàng)制度。工作結束後(hòu)用75%的乙醇擦拭工作台面(miàn)，用紫外線燈（建議安裝無臭紫外燈）進(jìn)行照射，同時(shí)注意實驗室的通風換氣。
國(guó)家原衛計委李大川處長(cháng)在近期會(huì)議上肯定了近年來分子檢測在臨床中的突出貢獻，随著(zhe)精準醫療的發(fā)展，分子檢測不僅有助于疾病的診斷分類，而且加深了人們對(duì)疾病的認識，指導疾病的靶向(xiàng)治療。但是NGS檢測的質量控制仍然存在問題：實驗室設計、實驗室人員水平、質量保證手段等。我們隻有有效運用“5M1E”分析法，規範NGS實驗室管理，保證質量，向(xiàng)臨床提供真實、客觀、準确的檢測結果，才能(néng)更好(hǎo)地爲大衆健康服務。
