RIP技術(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA結合蛋白免疫沉澱),是研究細胞内RNA與蛋白結合情況的技術。分析與目的蛋白結合的RNA。運用針對(duì)目标蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白複合物沉澱下來,然後(hòu)經(jīng)過(guò)分離純化就(jiù)可以對(duì)結合在複合物上的RNA進(jìn)行分析;即用抗體或表位标記物捕獲細胞核内或細胞質中内源性的RNA結合蛋白,防止非特異性的RNA的結合,免疫沉澱把RNA結合蛋白及其結合的RNA一起(qǐ)分離出來,結合的RNA序列可通過(guò)microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR或高通量測序(RIP-Seq)方法來鑒定。是了解轉錄後(hòu)調控網絡動态過(guò)程的有力工具,能(néng)幫助我們發(fā)現miRNA的調節靶點。
1. 細胞裂解液獲取
2. 磁珠的準備
3. RNA結合蛋白免疫沉澱
4. RNA純化
1. 貼壁細胞:用胰酶將(jiāng)細胞消化下來,或用細胞刮將(jiāng)細胞刮下來,將(jiāng)培養液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鍾,棄上清留細胞沉澱,幹冰運輸。
2. 懸浮細胞:將(jiāng)培養液1000轉/分,離心10min。棄上清留細胞沉澱,幹冰運輸。
3. 細胞上清:3000轉/分,離心15min取上清,上清立即用于實驗,或分裝後(hòu)于-20℃或-80℃保存。避免反複凍融。