背景簡介
數據非依賴性的掃描模式(Data-independent acquisition, DIA)是近幾年來發(fā)展的一種(zhǒng)新的質譜數據采集方式。可以對(duì)特定質量範圍内的所有母離子進(jìn)行碎裂，采集所有母離子的碎片離子信息進(jìn)行蛋白定性和定量。目前流行的蛋白質組學(xué)研究手段，如iTRAQ\TMT、 Label-free、SILAC采用的都(dōu)是數據依賴性的掃描模式(Data-dependent acquisition, DDA)。相對(duì)于DDA， DIA 具有更好(hǎo)的準确性和可重複性，是蛋白質組學(xué)研究的一大重要趨勢。下圖爲 DIA 定量技術原理圖：
技術優勢
靈敏度高，無歧視地獲得所有肽段的信息，不會(huì)造成(chéng)低豐度蛋白信息的丢失 循環時(shí)間固定，掃描點數均勻，定量準确度高 重複性好(hǎo)，重複樣品間的定量相關性可達到0.99以上。
技術路線
分析内容
樣本類型
蛋白質溶液，組織樣品、細胞及體液樣品（具體送樣量請咨詢各駐地項目經(jīng)理）
代表性文章
Collins B C , Hunter C L , Liu Y , et al. Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry[J]. Nature Communications, 2017, 8(1):291.Rouwette T , Sondermann J , Avenali L , et al. Standardized profiling of the membrane-enriched proteome of mouse dorsal root ganglia provides novel insights into chronic pain[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2016, 15(6):mcp.M116.058966.
Q1：蛋白質定量DIA和傳統的非标記定量有何優勢
A：傳統的非标記定量一般需要通過(guò)分級的方法開(kāi)展，耗時(shí)久、重複性差、數據結果可信度不高；蛋白定量DIA技術是新一代非标記定量技術，可通過(guò)更優的數據采集模式，在相同時(shí)間采集到更豐富的信息，壓縮周期的同時(shí)，大福度提高樣本間平行比較的重複性，數據結果可信度極高。
蛋白質定量DIA用于慢性疼痛的研究
Standardized Profiling of The Membrane-Enriched Proteome of Mouse Dorsal Root Ganglia (DRG) Provides Novel Insights Into Chronic Pain. Molecular & Cellular Proteomics. 2016.
研究背景
慢性疼痛是一種(zhǒng)治療方案有限的複雜疾病。雖對(duì)其發(fā)病機理進(jìn)行了多次研究，但各結果間存在較大不一緻性，主要受限于傳統蛋白質組shotgun技術固有的缺陷。發(fā)病機制依然不清晰。
研究結果
大量數據表明CD13、CD24、CD44、CD90、CD133、EpCAM等表面(miàn)标志物可以定義CSC，研究人員選擇CD24、CD133、EpCAM分選HuH1和HuH7不同細胞亞群，用于研究CSC生物學(xué)和分子水平異質性。免疫熒光染色表明，在兩(liǎng)種(zhǒng)細胞培養形态下（單層培養、球體培養）,兩(liǎng)個HCC細胞系均表現出明顯的細胞異質性。
實驗設計
炎症性疼痛和神經(jīng)性疼痛兩(liǎng)種(zhǒng)模型鼠及其對(duì)應control鼠共4組，各3個生物學(xué)重複
每個生物學(xué)重複由10-13隻鼠pooling而成(chéng)
解剖獲得同側背根神經(jīng)節膜部分提取蛋白進(jìn)行DIA蛋白定量
圖 實驗設計類型
主要發(fā)現
1）DDA建庫鑒定到3067個蛋白，迄今鑒定數最多的背根神經(jīng)節蛋白研究。
2）DIA四組都(dōu)鑒定到的蛋白有2526個，其中CFA和Vehicle都(dōu)鑒定到的有2581個；SNI和Sham都(dōu)鑒定到的2600個，表明實驗重複性較好(hǎo)。
3）炎症性和神經(jīng)性疼痛差異蛋白分别爲64和77，兩(liǎng)種(zhǒng)模式共有差異蛋白爲12個。
4）其中Serca蛋白在兩(liǎng)種(zhǒng)模式小鼠中表達量變化相反，表明兩(liǎng)種(zhǒng)疼痛的調控機制不同。
5）western blot和免疫組化對(duì)上述DIA結果進(jìn)行了驗證
圖 四組實驗模型的蛋白聚類分析
參考文獻Rouwette T , Sondermann J , Avenali L , et al. Standardized profiling of the membrane-enriched proteome of mouse dorsal root ganglia provides novel insights into chronic pain[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2016, 15(6):mcp.M116.058966
結構域注釋柱狀圖Interproscan是蛋白質結構域和功能(néng)注釋最常用的軟件之一。爲了能(néng)更全面(miàn)的進(jìn)行結構域的注釋，Interproscan整合了一些最常用的結構域數據庫，包括 Pfam、ProDom、 SMART 等結構域的數據庫，利用模式結構或特征進(jìn)行功能(néng)未知蛋白的結構域注釋，繪制結構域注釋的柱狀圖。橫坐标代表蛋白數目，縱坐标代表注釋到的 IPR 條目。
蛋白表達水平聚類圖
蛋白表達水平聚類分析用于判斷不同實驗條件下蛋白表達量的相關性。每個樣品都(dōu)會(huì)得到一個絕對(duì)或相對(duì)蛋白表達集合，將(jiāng)所有樣品表達集合并在一起(qǐ)，用于層次聚類分析和 K-means 聚類分析。
KEGG 富集通路圖在 KEGG 通路圖中，圈出了差異蛋白， 其中綠底色框内爲鑒定出的總蛋白， 藍色框标記的是下調差異蛋白，紅色 框标記的是上調差異蛋白，黃色框标 記的是通路中該功能(néng)對(duì)應的多個蛋白中既有上調差異蛋白、也有下調差異 蛋白。
差異蛋白互作分析利用 StringDB 蛋白質互作數據庫進(jìn)行 鑒定蛋白的互作分析，若在數 據庫中有相應的物種(zhǒng)，則直接提取相應物種(zhǒng)的序 列，若無，則提取近 源物種(zhǒng)的序列，然 後(hòu)將(jiāng)差異蛋白的序列與提取出的序列進(jìn) 行 blast 比 對(duì)，得出相應的互作信息，構建網絡圖。
