背景簡介
擴增子測序是對(duì)特定長(cháng)度的PCR産物或捕獲的片段進(jìn)行測序，分析序列中的變異。16S/ITS等擴增子測序即通過(guò)提取環境樣品的DNA，選擇合适的通用引物擴 16S/ITS的目标區域，通過(guò)檢測目标區域的序列變異和豐度，以研究環境微生物多樣性及群落組成(chéng)差異。16S rDNA爲編碼原/真核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列。ITS分爲兩(liǎng)個區域：ITS1位于真核生物rDNA序列18S和5.8S之間，ITS2位于5.8S和28S之間。
技術優勢
鑒定到“種(zhǒng)”：菌群多樣性鑒定率先精細到“種(zhǒng)”，分類更明确。
數據庫豐富：基于最新版Greengene和自建數據庫，和自主開(kāi)發(fā)的分析注釋工具，最多可鑒定4414個種(zhǒng)，
覆蓋2106個屬，可鑒定菌種(zhǒng)持續更新中。
低成(chéng)本：相比于傳統菌落鑒定，分析通量更高，檢測成(chéng)本更低。
技術路線
分析内容
樣本類型
菌體，DNA等
建議總DNA起(qǐ)始量：>20ng(較純DNA，無宿主及其他雜質污染)
近期用戶文章
1. Gao, S., et al.（2015）Tolerance response to in situ ammonia stress in a pilot-scale anaerobic digestion reactor for alleviating ammonia inhibition. Bioresource Technology 198:372.
2. Gou, H., et al. (2016) Assessment of microbial communities in PM1 and PM10 of Urumqi during winter." Environmental Pollution 214: 202-210.
3. Huang, Y., B. Yang, and W. Li. (2016) Defining the normal core microbiome of conjunctival microbial communities. Clinical Microbiology & Infection 22.7: 643.e7-643.e12.
4. Lv, Long‐Xian, et al. (2016) Alterations and correlations of the gut microbiome, metabolism and immunity in patients with primary biliary cirrhosis. Environmental Microbiology 18.7:2272.
5. Hu, Jinxiang, et al. (2016) Pepino (Solanum muricatum) planting increased diversity and abundance of bacterial communities in karst area. Scientific Reports 6:21938.
Q1：什麼(me)是嵌合體？
A：嵌合體的形成(chéng)：在PCR時(shí)，當不完全的DNA鏈與不同的模闆退火時(shí)，嵌合擴增子形成(chéng)，并引發(fā)衍生自兩(liǎng)種(zhǒng)不同生物學(xué)序列的新模闆的合成(chéng)。嵌合體在正常生物體中是不存在的。參考文獻：Robert C. Edgar, UCHIME2: improved chimera prediction for amplicon sequencing，2016.
Q2：PCoA分析有多種(zhǒng)不同計算方法及結果，甚至還(hái)有其他不同的分析方法來計算樣本間距離，我要選哪一種(zhǒng)爲最終的展示結果呢？
A：PCoA分析和其他不同的分析方法都(dōu)是用來展示組間差異和組内相似性的結果，不同的計算方法相當于是不同的角度來看這(zhè)個結果，老師隻要選擇與實驗設計最合适的結果進(jìn)行展示說(shuō)明即可。
Q3：α多樣性指數之間有什麼(me)區别嗎？
A：observed_species、chao1指數用來描述物種(zhǒng)的數目；而shannon、simpson指數則是用來描述物種(zhǒng)多樣性的，這(zhè)兩(liǎng)個指數不僅考慮了物種(zhǒng)的數目，還(hái)考慮了物種(zhǒng)的豐度，也就(jiù)是所有物種(zhǒng)的均勻度。如果每一個體都(dōu)屬于不同的種(zhǒng)，多樣性指數就(jiù)最大；如果每一個體都(dōu)屬于同一種(zhǒng)，則其多樣性指數就(jiù)最小。如果一個樣品物種(zhǒng)數目很多，但均勻度很差，即某個物種(zhǒng)豐度很高，但另一物種(zhǒng)豐度很低，就(jiù)會(huì)造成(chéng)observed_species、chao1指數高而shannon、simpson指數不高的現象。簡單說(shuō)： observed_species、chao1指數高，說(shuō)明樣品物種(zhǒng)數目多；shannon、simpson指數高，說(shuō)明物種(zhǒng)豐度以及均勻度都(dōu)很高。
Q4：微生物群落研究方法的區别？
A：16S rDNA測序：由于研究對(duì)象隻爲細菌的16S rDNA，因此16S測序技術更多隻用于研究群落物種(zhǒng)信息，也就(jiù)是利用OTU物種(zhǒng)分類、α和β多樣性分析等手段解答群落有什麼(me)物種(zhǒng)，物種(zhǒng)關系是什麼(me)等問題。因此，這(zhè)種(zhǒng)技術更多地隻能(néng)了解到環境對(duì)微生物的組成(chéng)有何影響，更偏向(xiàng)于單向(xiàng)關系研究。
宏基因組測序：宏基因組的研究對(duì)象爲群落所有DNA，因此研究範圍更廣。理論上不單隻可以了解群落的組成(chéng)和多樣性等物種(zhǒng)信息，同時(shí)，利用基因的注釋信息，還(hái)可以挖掘群落的核心功能(néng)和通路信息，在基因組層面(miàn)了解這(zhè)個群落到底有什麼(me)物種(zhǒng)，這(zhè)些物種(zhǒng)能(néng)夠發(fā)揮什麼(me)功能(néng)。隻有了解群落功能(néng)，才能(néng)知道(dào)它們對(duì)環境有什麼(me)影響，這(zhè)有利于進(jìn)行微生物與環境的雙向(xiàng)研究。
宏轉錄組測序：宏轉錄組以mRNA爲研究對(duì)象，同樣的通過(guò)數據組裝和比對(duì)，能(néng)同時(shí)挖掘物種(zhǒng)信息，基因功能(néng)信息，發(fā)現新基因，這(zhè)與宏基因組的作用沒(méi)太大差别。它的特點在于，因爲是轉錄組信息，因此在進(jìn)行基因研究的時(shí)候，可以關注到基因表達情況，從而更深入地了解基因如何被調控，基因表達如何應答環境變化等細節問題，在功能(néng)研究上更爲細緻。
定義正常人類眼結膜微生物群落的 "core microbiome"
研究背景
眼部細菌感染是很常見的，但運用傳統培養與分子生物學(xué)方法鑒定結膜微生物群具有明顯的局限性。而宏基因組研究可以彌補這(zhè)些方法的缺陷。
研究結果
黃钰森組運用Illumina高通量測序技術（MiSeq 測序平台）對(duì)結膜擦拭樣本中所有細菌的16S rDNA V3-V4高變區進(jìn)行測序。從測序數據中獲得操作分類單元（OTUs）。接著(zhe)，進(jìn)行微生物分類、豐度、 α多樣性等生物信息學(xué)分析。從31個結膜樣本中得到840373個高質量測序reads。不同種(zhǒng)類的OTU數量從159到2042，顯示出很高的微生物多樣性。這(zhè)些細菌菌落可分爲25個門和526個不同的屬。在屬的水平，棒狀杆菌屬（28.22%）、假單胞菌屬（26.75%）、葡萄球菌屬（5.28%）、不動杆菌屬（4.74%）、鏈球菌屬（2.85%）、 Millisia（2.16%）、厭氧球菌屬（1.86%）、大芬戈爾德菌屬（1.68%）、西蒙斯氏菌屬（1.48%）、韋榮氏球菌屬（1.00%）占整個微生物群落的76%以上，可能(néng)代表了正常結膜微生物群的“core genera” 。
圖 眼結膜微生物群落分類
參考文獻
Huang YS, et al. (2016) Defining the normal "core microbiome" of conjunctival microbial communities. Clinical Microbiology and Infection. doi:10.1016/j.cmi.2016.04.008.
樣品豐度柱狀圖根據物種(zhǒng)豐度表和物種(zhǒng)注釋表，默認選取豐度最高的20個物種(zhǒng)分類，進(jìn)行相對(duì)豐度計算，獲得相對(duì)豐度文件，繪制樣品豐度比較的柱狀圖，該柱狀圖以堆疊柱狀圖 (stacked bar chart)形式展現，便于更直觀地進(jìn)行樣品豐度的比較。在各個層級中， 可以直觀的看到優勢菌種(zhǒng)的表達情況及在各個不同處理中的變化趨勢。當然， 若是有關注稀有菌群的表達情況時(shí)，也可以展現所有物種(zhǒng)分類。
物種(zhǒng)分類熱圖（taxa heatmap）根據樣品相對(duì)豐度表，將(jiāng)各分類水平相對(duì)豐度最高20個的群落組成(chéng)數據根據分類 單元的豐度分布或樣本間的相似程度加以聚類，根據聚類結果對(duì)分類單元和樣本 分别排序，并通過(guò)熱圖加以呈現。通過(guò)聚類，可以將(jiāng)高豐度和低豐度的分類單元 加以區分，并以顔色梯度及相似程度來反映多個樣品在各分類水平上組成(chéng)的相似 性和差異性。
物種(zhǒng)注釋結果KRONA展示使用Krona軟件動态可視化展示單樣品在不同分類水平注釋結果，通過(guò)調節不同的參數來調整展示的圖片。如果項目比較關注某一個物種(zhǒng)，可通過(guò)在Search欄中輸入關注物種(zhǒng)的名稱，可快速定位到關注物種(zhǒng)在樣品中的表達情況。通過(guò)點擊左側欄中的樣品名，來展示該樣品的物種(zhǒng)注釋表達情況。
RDA分析RDA分析實際上是約束化的主成(chéng)分分析（PCA），它的優點是考慮了環境因子（如土壤研究中的PH值，酸堿度，疾病研究中臨床理化因子等）對(duì)樣本的影響， 可同時(shí)反映樣本，環境因子和物種(zhǒng)三者或兩(liǎng)兩(liǎng)之間的關系。
LEfSe分析LEfSe分析主要目的是進(jìn)行兩(liǎng)組或多組之間的比較，找到不同組間在豐度上有顯著性差異的物種(zhǒng)（biomarker）。
Spearman關聯分析主要目的是觀察微生物間（或OTU）的相互作用，通過(guò)斯皮爾曼（Spearman）關聯系數計算等方法，找尋微生物在不同環境下的可能(néng)的相互“協作”或“競争” 的關系。
