Q1：取樣用的離心管在使用前需要進(jìn)行預處理嗎？
A：需要。爲了防止樣品污染，建議用紫外交聯儀照射處理20分鍾。

Q2：樣品取出後(hòu)是直接保存在-80℃的冰箱中嗎？是否還(hái)需要其他處理呢？
A：分離後(hòu)的細胞立即放入裂解液中，裝在裂解液中的樣品可在-80℃保存至多三個月，幹冰保存送樣即可。

單細胞轉錄組測序揭示人CD127+先天淋巴細胞的異質性

研究背景
先天淋巴細胞（ILCs）是一種(zhǒng)免疫細胞，它通過(guò)釋放可溶性的因素調節對(duì)病毒、細菌和寄生蟲的早期免疫反應。這(zhè)些細胞可以根據細胞表面(miàn)的轉錄因子及細胞因子被分爲三個亞型，每種(zhǒng)亞型都(dōu)有不同的功能(néng)。

方法流程
取材：用流式細胞儀分選患有阻塞性睡眠呼吸暫停綜合症患者的扁桃體組織中的ILCs（Lin−CD127+）和NK cells（CD45+Lin−CD127− NKG2A+CD56+CD16− ） 。
建庫：1. Smart-seq2進(jìn)行單細胞擴增；2. Nextera XT DNA Sample Preparation Index Kit構建文庫。
測序：Illumina HiSeq 2000  3×106reads /樣本
分析：1. 質控、數據篩選；2. 序列比對(duì)、基因表達分析及标準化處理；3. t-SNE細胞分型分析；4. SCDE基因差異表達分析。

研究結果
1.  細胞分型分析
采用PCA（主成(chéng)分分析）和t-SNE對(duì)ILC中847個表達的基因進(jìn)行分型分析，將(jiāng)細胞分爲4類：ILC1、ILC2、ILC3、NK cells。
2. SCDE基因差異表達分析
應用SCDE軟件包對(duì)4類細胞的差異基因進(jìn)行分析，找出共有及特有差異基因，結果發(fā)現，CD127+ILCs中共有的差異基因的表達量比NK細胞中明顯要高。
3. ILC1、ILC2、ILC3差異基因表達分析
結果表明，ILC1 cells共有79個上調表達基因，參與幹擾素γ的調控，ILC2 cells共有58個上調表達的基因，在前列腺素、Notch信号通路及環境感應中發(fā)揮作用，ILC3 cells共有371個上調表達的基因，根據GO注釋有85個與免疫相關，且存在未知功能(néng)的基因。
4. ILC3細胞亞型分析
采用PCA和t-SNE分析ILC3中1,958個注釋的免疫基因，將(jiāng)ILC3分爲3個亞型：Cluster A、Cluster B、Cluster C, 通過(guò)對(duì)這(zhè)3種(zhǒng)亞型細胞的分析，發(fā)現了新的免疫細胞CD62L+ ILC3。

研究結論
本研究通過(guò)對(duì)648個單細胞進(jìn)行單細胞轉錄組的分析，應用t-SNE細胞分型、SCDE基因差異表達分析，在ILC3中發(fā)現新的免疫細胞CD62L+ ILC3。

參考文獻
Åsa K Björklund, Forkel M, Picelli S, et al. The heterogeneity of human CD127+ innate lymphoid cells revealed by single-cell RNA sequencing[J]. Nature Immunology, 2016, 17(4):451.