背景簡介
宏轉錄組學(xué)是在轉錄水平，以特定樣本中微生物群落的全部轉錄本爲研究對(duì)象，分析微生物群落的基因表達與調控。宏轉錄組測序，避開(kāi)了微生物的分離培養，爲研究人員提供了從整體水平研究特定環境，特定時(shí)期微生物群落基因組轉錄情況以及轉錄調控規律的高效工具。
技術優勢
樣本處理個性化：由于微生物樣本組成(chéng)複雜，將(jiāng)根據不同樣本特點，針對(duì)性進(jìn)行樣本處理和文庫制備。
數據分析優化：精選數據拼接軟件，最大程度獲取微生物群落基因組轉錄信息。
注釋全面(miàn)：采用最新版數據庫，更精确地注釋和分析微生物群落基因表達信息。
跨組學(xué)分析：從宏基因組到宏轉錄組，多個角度解析微生物群落結構與功能(néng)。
技術路線
分析内容
樣本類型
樣本類型：培養的細菌(≥ 5×106)，組織，環境樣品，總RNA等
RNA總量：≥ 5 μg，濃度：≥50ng
OD值：260/230≥1.5；260/280≥1.8
完整性（bioanalyzer2100）：RIN值≥7,28S/18S≥0.7，或者峰型銳利，模拟電泳圖無彌散，5S峰顯示正常的樣品
Q1：對(duì)于小型動物，如果采樣時(shí)不能(néng)分離腸道(dào)和腸道(dào)内容物，宿主對(duì)宏轉錄組的影響很大，這(zhè)種(zhǒng)情況下，需要如何解決？
A：對(duì)于這(zhè)種(zhǒng)問題可以從以下兩(liǎng)個方面(miàn)進(jìn)行解決:
1.在實驗建庫過(guò)程中去除宿主污染（比如宏轉錄組中用去polyA法去除宿主mRNA）；
2.另一種(zhǒng)更直接的方法是，加大測序數據量，通過(guò)與宿主基因組比對(duì)去除宿主污染，但該方法前提是需要有宿主參考基因組，如果宿主沒(méi)有參考基因組，當污染很高的情況下，基本上沒(méi)有辦法去除宿主污染。
Q2：宏轉錄組測序完成(chéng)後(hòu)是否需要驗證？是用qPCR方法驗證嗎？
A：如果是群落水平的驗證，qPCR可以作爲一個考慮的方法。但是宏轉錄組的微生物含量非常不穩定，qPCR不一定具有代表性。最好(hǎo)的辦法是找到基因的菌落歸屬，然後(hòu)做一些單細菌克隆驗證。
Q3：如果不做宏基因組測序實驗，那是不是也沒(méi)有做宏轉錄組測序的必要？
A：宏轉錄組和宏基因組關注的點不一樣，宏轉錄組在建庫中可能(néng)會(huì)去掉一些RNA或者功能(néng)分析，但是實際上宏轉錄組相關的文章很多，因此不需要擔心這(zhè)個問題。
宏基因組和宏轉錄組聯合分析綿羊瘤胃中微生物與甲烷産量的關系
反刍動物是單一且最大的人爲溫室氣體甲烷來源的代表。甲烷由反刍動物消化道(dào)中的産甲烷古菌産生。雖然相同品種(zhǒng)的單個動物之間甲烷産量的差異已被觀察到，這(zhè)種(zhǒng)變化的依據仍有待闡明。爲探索這(zhè)種(zhǒng)甲烷産量的機理，研究人員測定了22隻綿羊的甲烷産量，結果揭示甲烷産量具有可重複、可量化的特征。宏基因組和宏轉錄組測序證實，甲烷排放量高和低的綿羊都(dōu)具有類似的産甲烷菌豐度和甲烷生成(chéng)途徑基因。然而，對(duì)于甲烷排放量高的綿羊，産甲烷途徑基因的轉錄大幅增加。鑒定出一組瘤胃産甲烷菌，這(zhè)些産甲烷菌的甲烷生成(chéng)途徑轉錄譜與甲烷産量相關。上圖爲瘤胃産甲烷菌進(jìn)化分析。
參考文獻
W Shi，et al. (2014)Methane yield phenotypes linked to differential gene expression in the sheep rumen microbiome. Genome Research. doi/10.1101/gr.168245.113
樣本物種(zhǒng)豐度柱狀圖
根據物種(zhǒng)注釋結果及豐度統計，默認選取各分類水平（界門綱目科屬種(zhǒng)）豐 度最高的20個物種(zhǒng)，進(jìn)行樣品豐度柱狀圖的繪制，該柱狀圖以堆疊柱狀圖 (stacked bar chart)形式展現, 便于更直觀地進(jìn)行樣品間物種(zhǒng)豐度的比較。 在各個層級中，可以直觀的看到優勢菌種(zhǒng)的表達情況及在各個不同處理 中的變化趨勢。
KEGG注釋統計根據KEGG注釋總表，可以對(duì)KEGG注釋的總體情況進(jìn)行Unigene數目的統計。
抗生素耐藥基因注釋CARD全稱是Comprehensive Antibiotic Resistance Database，目前該數據庫 仍在不斷地更新，該數據庫以ARO（Antibiotic Resistance Ontology）爲核心對(duì)耐藥性數據進(jìn)行整理，以達到數據實時(shí)更新的效果。通過(guò)對(duì)Unigene進(jìn)行對(duì) 應的抗生素耐藥性注釋，并統計抗生素耐藥功能(néng)的豐度。
eggNOG功能(néng)注釋eggNOG是一個用于同源聚類基因群注釋的專業數據庫，它包括來自原始COG/KOG的功能(néng)分類，以基于分類學(xué)的功能(néng)注釋。
